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EGFR-ubitaADC 활성에 대한 E3 리가아제 결합의 기여도를 엄밀하게 규명하기 위해, 우리는 RSPO2 FU 도메인에 R65A/Q70A 돌연변이를 도입한 리가아제 결합 결핍 대조군 구조체를 추가로 제작했습니다. 이 돌연변이는 단백질 접힘이나 안정성을 크게 손상시키지 않으면서 RNF43 및 ZNRF3와의 결합을 없애는 것으로 알려져 있습니다.32 이 돌연변이는 이전 연구에서 FU 도메인의 전반적인 물리화학적 특성을 유지하면서 E3 리가아제와의 상호작용을 선택적으로 저해하는 것으로 잘 규명되었습니다. 따라서, EGFR-ubitaAb R65A/Q70A 와 그에 상응하는 ADC인 EGFR-ubitaADC R65A/Q70A 를 생산하고 리가아제 결합 능력을 갖춘 대조군과 함께 특성을 분석했습니다. 환원 조건과 비환원 조건에서 수행한 SDS-PAGE 분석을 통해 EGFR-ubitaAb R65A/Q70A 의 순도와 구조적 완전성을 확인했습니다 ( 그림 S6 A). EGFR-ubitaADC에 적용된 것과 동일한 화학효소적 당화공학 전략을 사용하여 MMAE를 EGFR-ubitaAb R65A/Q70A 에 부위 특이적으로 접합시켰으며, 중간 생성물과 최종 생성물은 SDS-PAGE를 통해 검증하였다( 그림 S7 A). 소수성 상호작용 크로마토그래피 분석 결과, EGFR-ubitaADC R65A/Q70A 의 약물-항체 비율 분포가 잘 정의되어 있었고 , 평균 DAR은 약 1.8이었다( 그림 S7 B). 이는 효율적인 약물 도입을 확인시켜 준다.